来自肯特大学的Tara A. Eastwood等人在期刊Cell
Reports Methods上发表了题为High-yield
vesicle-packaged recombinant protein production from E. coli的论文。论文描述了一种大肠杆菌中通过膜结合囊泡输出重组蛋白的系统。通过一个简单的肽标签，可以在囊泡包装内高效生产功能蛋白，从而简化纯化过程并实现长期储存。该方法可以从细菌中产出不溶的、有毒的和其他有挑战性的蛋白质。
引言
重组蛋白的生产引发了基础研究、生物技术和生物治疗行业的一场革命，并在一系列重大疾病的治疗中发挥着关键作用。取决于获得功能蛋白所需的结构复杂性和细胞依赖性修饰，目前的大多数商业重组蛋白都是通过细菌或真核细胞表达系统生产的。大肠杆菌是在学术界与工业界生产重组蛋白的一个极具吸引力的系统，不仅价格低廉，易于成批高密度培养，且已有各式各样的菌株、试剂、启动子和工具被开发出来用于大肠杆菌功能蛋白的生产。合成生物学策略应用正在不断发展，克服翻译后修饰和复杂蛋白质折叠应用中常见的局限。
在此，研究人员描述了一种创新的表达系统，该系统可以将大肠杆菌中各种重组蛋白诱导包装至膜囊泡中。他们发现了一种简单的肽标签，它能产生高产的囊泡包装功能蛋白，并将有毒、不溶及含二硫键的蛋白质分隔开，还能将囊泡释放至培养基中以进行高效的下游处理。这些释放出的蛋白质包装囊泡可以从培养基中快速分离，还为功能性重组蛋白的稳定长期储存提供微环境。因此，该系统对从发现科学到应用生物技术和医学领域的广泛应用都大有裨益。
结果与讨论
图1
在开发以鉴定α-突触核蛋白寡聚效应物为目的的基于荧光的药物筛选方法过程中，研究者偶然发现在大肠杆菌中重组表达全长人a-突触核蛋白（aSyn）可释放细胞外含aSyn的膜囊泡，这些囊泡中通常含有细菌膜蛋白OmpA（图1A）。进一步分析发现，aSyn的α-螺旋氨基末端的38个残基足以使大肠杆菌细胞形成OmpA标记的胞外膜结合囊泡并将其释放到培养基中（图1B）。体外分析表明，这种命名为囊泡成核肽（VNp）的aSyn衍生多肽可与由重组大肠杆菌膜脂组成的囊泡相互作用并稳定其α-螺旋结构（图2）。FLIM - FRET结果显示，VNp融合物在体内与大肠杆菌内膜特异性结合（图2），这与含重组VNp的囊泡形成并释放到生长介质中的过程相吻合（图1A、1C-1E）。这一过程不会影响细胞生长，因此可驱动细胞大规模生产囊泡（图1E、图2），从而在生长培养基以及培养结束后收获的细胞中分离重组蛋白，大大节省时间和资源。
图2
将编码VNp与编码单体荧光蛋白mNeongreen的序列融合，可产生大的VNp-mNeongreen蛋白囊泡并释放到胞外（图1F、1G）。免疫电镜结果证明mNeongreen完全定位于囊泡腔内（图1G、3）。将培养液低速离心后用无菌的0.45mm PES过滤器过滤能有效地分离出菌体内的囊泡（图1H、1I和3）。通过DLS分析，分离得到的VNp诱导的囊泡平均多分散指数大于1，说明囊泡在培养基中的大小分布广泛。此外，培养一天（-10.5
mV）和培养4个月的囊泡（-11.1 mV）之间的zeta电位（根据峰值计算） 没有明显差异，囊泡中含有的VNp-mNeongreen在3个月内也没有明显减少（图3）。因此，分离的囊泡能为可溶性重组蛋白的有效长期储存提供稳定环境(图3)。通过对分离出的囊泡进行质谱蛋白分析，确定了一步过滤法获得的融合蛋白的纯度，发现其纯度足以满足广泛的应用需求（图1I和图3），还支持必要时囊泡超声后的后续纯化。上数据支撑了一个VNp与大肠杆菌菌膜相互作用并随后结合成囊泡释放到培养基中的模型（图1J）。
该系统提供了一种简单而有吸引力的机制，可将膜包装的重组蛋白释放到培养基中，从而提高重组蛋白的产量和后续处理能力。虽然mNeongreen可以快速定量释放到培养基中的可溶性目标蛋白，但研究者还使用了更广泛的蛋白（如膜结合蛋白、含二硫键蛋白或其他不溶性或毒性蛋白），包括一些生物制药模型，用于代表不同的物理性质和表达挑战，以测试该技术在表达生命科学界所需的特定分子方面的适用性。每种蛋白质的表达都分别以VNp或VNp- mNeongreen氨基末端融合蛋白的形式进行检测，并与等效的非VNp 融合蛋白的表达进行比较（图1K-1M和图3）。
图3
输出囊泡内双分子荧光互补（BiFC）VNp融合对的荧光显示，VNp融合蛋白有效增强了目标蛋白的表达，还支持大小从不到1kDa（VNp-His6）到85 kDa（VNpmNeongreen-etanercept）的单个蛋白及蛋白复合物的表达（图4）。重要的是，VNp融合提高了目标蛋白的总体产量。设计的锚蛋白重复蛋白DARPin
Off7（DARP）几乎达到了每升摇瓶培养物产1克可溶性蛋白的产量。有趣的是，虽然添加mNeongreen标签可以提高红细胞生成素（EPO）、依那西普（etanercept）和人类生长激素（hGH）的表达，但添加25 kDa的mNeongreen荧光蛋白标签却导致了每种模型治疗蛋白总产量的降低，原因可能是蛋白质的整体体积增大，以及mNeongreen对细菌细胞的生长产生不同程度的负影响（图2）。此外还观察到在表达不同VNp融合物的培养物中，VNp诱导囊泡的大小或丰度没有显著差异，因此丰度差异很可能是囊泡内部表达和包装效率的差异造成的。烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶裂解VNp-mNeongreen-TEV-DARP和VNp-mNeongreen-TEVuricase上的VNp-mNeongreen标记并不会影响最终纯化的DARP 和尿酸酶蛋白的溶解度（图4），这表明表达后VNp标签对于蛋白溶解度的维持不是必需的。
VNp表达系统在更大容量发酵培养物中的应用进一步验证了该系统的有效性（图 4）。在15L的发酵容器中，在大肠杆菌中对VNp-DARP进行24h的表达诱导。VNp-DARP融合蛋白在此期间持续表达和输出（图4），产量超过了1.4g/L，占培养基中观察到的蛋白总量的65%。
该系统的多功能性通过生产正确折叠的蛋白（如mNeongreen）、膜结合蛋白（FGF21）以及具有酶活性的蛋白（尿酸酶）得到进一步证明（图4）。囊泡分离出的VNp-尿酸酶不仅与从细胞团中纯化出的尿酸酶具有同样的酶活性，而且与4℃下在缓冲液中保存2个月的纯化蛋白相比，VNp-尿酸酶在分离出的囊泡中于4℃保存相同时间后仍能保持较高的活性（图4），这表明囊泡为其蛋白质货物提供了稳定的环境。
通过 VNp 融合技术可以生产出原本不溶或会降低细菌细胞活力的可溶性蛋白质（如DNA酶、etanercept、EPO和hGH）（图4）。
图4
大部分可溶性重组蛋白（含二硫键的蛋白质etanercept和hGH）仍留在细胞内。电镜数据显示，将VNp-mNG与etanercept（一种由TNF和IgG1融合而成的抗炎药物）融合会影响内膜的VNp 重塑，从而诱导含有 VNp 融合的内化细胞膜结构（图5A和5B）。这种TNF-IgG1治疗性融合蛋白不仅是依赖二硫键的二聚体，而且当从VNp诱导的细胞膜囊泡中分离出来时还表现出适当的配体结合特性。TEV蛋白酶依赖性蛋白水解去除VNp-mNeongreen融合体后，与蛋白A结合的能力得以保持（图5C-5E）。同样地，从VNp-mNG-TEV-DARP和VNp-mNG-TEV-uricase中水解VNp-mNG也不会影响DARP或尿酸酶的溶解度（图5F），这表明VNp在表达后不改变溶解度。
图5
为了探索二聚化是否足以诱导VNp融合蛋白内化，研究者在VNp和货物间引入亮氨酸拉链（LZ）序列，从而创建了稳定的α-螺旋VNp二聚体(图4和6)。VNp-LZ融合体的表达诱导了细胞质中充满VNp-LZ融合蛋白的囊泡结构的形成，该结构由含有CydAB的内膜组成（图6B-6D）。虽然目前还不清楚确切的分子基础，但数据表明，二聚化的VNp融合蛋白可促进细菌膜向内而非向外弯曲。这些结果为在细胞膜结合结构内生成重组蛋白提供了一种有趣的方法，进一步促进大肠杆菌产出含二硫键蛋白和其他不溶或有毒蛋白。
在该方法成功的基础上，研究者对VNp氨基酸序列进行简单修改以调节形成含VNp融合蛋白囊泡的能力，以验证是否会提高分泌蛋白的产量。因此，研究者系统地测试了来自β型和γ型突触核蛋白异构体的等效VNp序列，以及通过修改螺旋表面目标残基电荷和侧链长度而产生的一系列构建体。结果发现，他们不仅可以在较宽的培养温度范围内增强囊泡输出（VNp6），还可以将VNp的大小缩短至 20个残基（VNp15），从而增强目标模型生物药品DARP和stefin A的分泌，使其产量超过 2.5 克可溶性重组蛋白/升细菌培养液。这些高产率在学术和工业环境中均可重现。
图6
VNp系统具有灵活性，可以在不同的大肠杆菌菌株（如 BL21、λ、JM109和K12菌系；图7）中生成囊泡包装蛋白，因此非常适合生产经专业大肠杆菌宿主修饰的合成蛋白。例如，VNp系统可在W3110细胞中发挥作用，从而产生充满重组蛋白的囊泡，降低免疫原性反应。VNp融合蛋白可由多种质粒（包括基于pUC19和pBR322的衍生物）表达，并且可由不同的启动子（如 T7、鼠李糖）和诱导剂驱动表达（图7），这些特性使其成为真正的多功能系统。
图7
与大肠杆菌中在没有重组蛋白表达的情况下自然形成的原生外膜囊泡不同，这里描述的VNp系统是通过与内膜的相互作用形成囊泡。此外，重组蛋白在大肠杆菌细胞中表达时，并不存在于释放到培养基中的原生囊泡中，而VNp系统则通过简单的标记机制将定向重组蛋白标记到囊泡中 。这种简单的多肽融合技术提高了大肠杆菌中多种重组蛋白的产量，并简化了它们的下游加工过程。重要的是，该方法很容易以毫克或克为单位分离出不溶的或有毒的蛋白，这表明它对任何人们感兴趣的重组蛋白的表达都是一个有吸引力的起点。值得注意的是，从囊泡中分离蛋白质不大可能提供完全避免内毒素的途径，因为蛋白质在正常的分泌过程或均质化过程中总会被内毒素包裹。因此，根据下游应用的不同，富集的VNp衍生蛋白可能需要进一步纯化。本文所提及的这种方法有可能使经过适当基因修饰的稳定表达菌株在长时间培养中持续释放蛋白质。而另一个好处是，当囊泡保持在4℃时，蛋白质的稳定性和酶活性得以保持。随着这一系统的应用越来越广泛以及进一步的改进和调整，预计其影响将十分显著。因此可以预见这一多功能系统将被迅速应用到广泛的下游工艺及其他应用中。（黄燊曦摘译）
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36936078/
