猪流行性腹泻（PED）
它是一种高度传染性的胃肠道疾病，具有巨大的经济影响，影响所有年龄段的猪。 PED的预防和控制是通过对母猪进行疫苗接种以及通过初乳对仔猪进行免疫来实现的。 尽管使用了商业疫苗，G2b猪流行性腹泻病毒（PEDV）在中国的流行仍在继续腺病毒包装技术，这引发了人们对现有疫苗的功效以及开发新型疫苗的必要性的质疑。 腺病毒血清型5（Ad5）具有转导效率高、宿主细胞范围广、能够感染各阶段细胞等优点。 在这项研究中，作者使用Ad5载体表达spike(S)的免疫原性蛋白，并通过诱导体液免疫产生PED候选疫苗。 rAd5-PEDV-S 可预防 PED 引起的仔猪体重减轻、腹泻和肠道损伤。 这种新型候选疫苗株具有在养猪业中使用的潜力。
腺病毒双质粒包装系统
作者利用AdMax腺病毒包装系统将携带外源基因的腺病毒穿梭质粒和携带大部分腺病毒基因组的辅助包装质粒共转染入细胞，然后利用Cre/loxP重组酶系统产生重组腺病毒。 昌瑞生物科技也可以提供此项技术服务。
文本：
2023年12月4日（影响因子：3.7）在线发表了西南民族大学张斌团队的最新研究进展：“and of a new G2b PEDV spike in PEDV”。 本文研究了一种新疫苗的开发，该疫苗使用表达 G2b PEDV 刺突蛋白的重组腺病毒来保护仔猪免受猪流行性腹泻病毒 (PEDV) 的感染。 研究表明，疫苗免疫可诱导母猪产生显着的免疫反应，从而对仔猪产生被动保护。 研究发现该疫苗比商业疫苗更有效，尤其是肌肉注射时。 接种疫苗的母猪所生的仔猪在感染 PEDV 时腹泻和体重突然减轻减少。 该疫苗显示出作为预防养猪业 PED 的候选疫苗的潜力。
通过母猪疫苗接种将母源抗体转移给仔猪是在感染早期预防PEDV感染的最佳方法。 与其他冠状病毒一样，PEDV的S基因也表现出显着的变异。 此前的研究表明，G1和G2菌株的S蛋白差异很大，相似率仅为90-96%。 由于目前PEDV的基因变异，现有疫苗的有效性面临挑战。 商业疫苗不能完全预防哺乳仔猪的 PEDV 感染。 现有的 PED 商业疫苗不提供交叉保护，其他冠状病毒的交叉保护也同样较差。 灭活疫苗和减毒活疫苗研制周期长，不能对高毒力的异源毒株提供足够的保护。 为了有效控制PEDV感染，迫切需要具有更高功效的疫苗。 人腺病毒血清型5（Ad5）具有转导效率高、宿主细胞范围广、能够感染不同阶段细胞等优点。
作者旨在使用基于表达 S 蛋白的 Ad5 的重组腺病毒开发一种针对 PED 的疫苗。 在母猪中评估了疫苗的潜在免疫反应，并在新生仔猪中进行了一项具有挑战性的实验，以确定疫苗接种后的功效。 这些发现为 PED 疫苗的研究开发奠定了基础。
rAd5-PEDV-S的构建及鉴定：
重组腺病毒（rAd5-PEDV-S）通过同源重组成功包装在细胞中，对细胞产生典型的细胞病变效应（图1A）。 对连续传代的rAd5-PEDV-S进行PCR分析，每次传代均能检测到S基因，测序证实结果准确（图1B），表明重组腺病毒的遗传稳定性。 通过 成功验证了S蛋白的表达（图1C）。 S蛋白的表达也通过IFA成功验证，在荧光显微镜下观察到特异性绿色荧光（图1D）。 这些结果表明rAd5-PEDV-S S蛋白在细胞中高效表达。
图1
rAd5-PEDV-S 的构建和表征
(A) rAd5-PEDV-S 在细胞中诱导的细胞病变效应 (CPE)。 左图代表由rAd5-PEDV-S引起的CPE，右图代表正常细胞。
(B) PCR检测rAd5-PEDV-S在细胞内的遗传稳定性，“P”表示传代。 “+”表示阳性对照，“-”表示阴性对照。
(C) rAd5-PEDV-S在细胞中表达的S蛋白的 blot分析
(D) 细胞中 rAd5-PEDV-S 表达的 S 蛋白的免疫荧光测定 (IFA) 分析。
rAd5-PEDV-S层析纯化
为了提高病毒纯度，使用 Layer 700 BA（使用阴离子和疏水相互作用以及分子筛分）和 Q（使用离子交换）层析纯化 rAd5-PEDV-S。 所得纯化品的光密度比(OD260/OD280)为1.28，表明纯度满足要求。 使用蛋白质印迹法证实纯化的rAd5-PEDV-S感染细胞中S蛋白的表达。 使用里德法计算的组织培养感染剂量为50%()，为1×108.24/0.1 mL。 病毒颗粒总数（VP）为1.8×/mL。 这些结果表明rAd5-PEDV-S已被成功纯化。
rAd5-PEDV-S 在母猪中诱导 PEDV 特异性 IgA 和 IgG 抗体
图2
母猪 rAd5-PEDV-S 的体液免疫反应
(A) 免疫程序示意图。 母猪在产前 5 周接种一次疫苗，在产前 2 周接种相同剂量的二次疫苗，在产前 5 周或产前 2 周接种一次疫苗。
(B) 初乳中的 IgA 抗体滴度。
(C) 血清中 IgG 抗体滴度。
(D) Vero 细胞初乳测定中的 NAb 滴度。
(E) Vero 细胞血清测定中的 NAb 滴度。
图 S1 接种疫苗的母猪的临床症状。
(A) 母猪接种疫苗后的直肠温度；
(B) 母猪接种疫苗后的精神状态评分；
(C) 接种疫苗后母猪的食欲评分。
这些结果表明rAd5-PEDV-S疫苗可以有效诱导母猪高水平的体液免疫反应。
rAd5-PEDV-S 保护仔猪免受 PEDV 攻击
为了测定rAd5-PEDV-S对母猪的保护作用，选取rAd5-PEDV-S免疫母猪和其他组出生的5日龄乳仔猪进行PEDV感染检测。 所有接受 PEDV-KB4 毒株攻击的仔猪均表现出典型的 PED 症状，包括腹泻。 然而，rAd5-PEDV-S IM 组的腹泻严重程度较轻，并在感染后 5 天有所改善（图 3A）。 相反，PBS 组的仔猪表现出严重腹泻（图 3A）。 与其他组仔猪相比，rAd5-PEDV-S IM组的日增重相对稳定（+0.049 kg/天）。 PBS 组仔猪的日增重（-0.159 公斤/天）下降最为显着（-0.159 公斤/天）（图 3B）。 为了评估PEDV在攻毒仔猪粪便中的复制情况腺病毒包装技术，采用定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）方法定量检测PEDV的量。 rAd5-PEDV-S IM 组样品的病毒载量显着低于 PBS 组（P < 0.05）（图 3C）。 值得注意的是，rAd5-PEDV-S IM 组的病毒载量在 6 dpi 时开始下降。 7 dpi 时，它们显着低于商业灭活疫苗组（图 3C）。 rAd5-PEDEV-S IM组和市售灭活疫苗组仔猪存活率为100%（5/5）。 相比之下，IN 组的存活率为 80% (4/5)，PBS 组的存活率为 0% (0/5)（图 3D）。 采用苏木精和伊红染色观察PEDV感染仔猪小肠的组织病理学变化。 在仔猪的一些回肠组织中观察到粘膜上皮细胞脱落和炎症细胞浸润（图4）。 这些变化在PBS对照组中最为明显，粘膜层显示广泛的粘膜上皮细胞脱落和肠绒毛脱落。 相比之下，其他组没有明显的病理变化（图4）。 这些发现表明，rAd5-PEDV-S 可以减少 PEDV 增殖并减轻 PEDV 感染仔猪小肠组织的病理。 母猪和仔猪肌肉注射rAd5-PEDV-S可抵抗PEDV感染，临床症状较少，肠道病理损伤也较小。
图3 PED感染仔猪的临床症状
(A) 感染 PED 仔猪的腹泻。
(B) 感染 PED 仔猪的每日体重增加。
(C) PED 感染仔猪的 PEDV 基因组 RNA 拷贝。
(D) 感染 PED 仔猪的存活率。
图4
PED感染仔猪的病理分析。 收集每头猪的回肠，用苏木精和伊红染色，并用光学显微镜检查。
总结：
作者成功开发了基于人5型腺病毒、表达G2b PEDV刺突蛋白的重组双质粒腺病毒系统，命名为rAd5-PEDV-S。 通过免疫母猪，发现rAd5-PEDV-S可以诱导母猪产生PEDV特异性体液免疫反应，包括初乳和血清中的IgA和IgG，以及循环中的中和抗体。 与商业灭活疫苗相比，rAd5-PEDV-S更有效，并且肌肉注射途径比鼻腔注射更有效。 值得注意的是，一次或两次肌肉注射之间的免疫效果没有显着差异。
通过对5日龄仔猪进行PEDV感染实验，发现母猪接种rAd5-PEDV-S后出生的仔猪在面临PEDV攻击时腹泻和体重减轻较少。 rAd5-PEDV-S肌注组仔猪粪便中PEDV RNA的表达量显着低于其他组，且rAd5-PEDV-S肌注组仔猪全部存活过感染期。
本研究结果表明，给妊娠母猪接种rAd5-PEDV-S可以诱导母猪产生免疫反应，对仔猪保护效果良好。 该研究为rAd5-PEDV-S作为PED候选疫苗的潜力提供了重要参考。
【昌瑞生物】腺病毒包装服务类型：
1、过表达腺病毒：根据客户提供的基因信息，合成目的基因的cDNA序列，连接至腺病毒载体，通过包装获得目的基因的过表达腺病毒。
2、干扰腺病毒：根据客户提供的基因信息，设计合成3个针对目的基因的shRNA模板，并分别连接到腺病毒载体上，通过包装获得3个干扰目的基因的腺病毒株。 这就达到了保证至少一个基因能够有效干扰目的基因表达的目的。
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控制方式
原核抗性
发起人
荧光标记
过度表达
巨细胞病毒
荧光蛋白/
干涉
U6
荧光蛋白/
/Cas9
U6
荧光蛋白/
一般情况下，如果含有对包装过程产生不利影响的序列，如有毒基因（如促凋亡基因），则递送效价可以达到1*/mL~1*/mL； 破坏包装细胞或病毒的完整性（导致细胞聚集的膜蛋白等基因）； 易于重排或二级结构的序列（例如重复序列或具有高 GC 含量的序列）不一定能提供滴度。
