病毒载体包装过程是复杂的，在做病毒包装实验中，科研工作者常见到一些难题。为了让你们在病毒包装这块少走弯路，《细胞基因编辑小课堂栏目》特邀赛业生物细胞化学学产品经理对于病毒包装常见的弊端为你们进行心得总结与心得分享。之前有两期给你们分享了慢病毒包装FAQ，回顾请点这里。有朋友留言说想看腺相关病毒（Adeno-virus,AAV）包装，有求必应的小赛这就安排上！
Q1：AAV有什么特性呢？
Q2：实现AAV在动物体内表达应该留意这些关键点？
1.血清型的选用。AAV的抗原型主要由AAV衣壳蛋白的结构所决定，不同的衣壳蛋白结构识别不同的细胞表层受体，因此血清型的选用会影响AAV的感染效率、组织亲和性、和起初表达的时间。
2.启动子的选用。是选取广谱性开启子还是特异性启动子。相比于血清型的组织特异性，特异性启动子可推动细胞的特异性，因此对特异性要求较高的探究，可以选取某些细胞特异性表达的启动子。
3.注射方法。对于可以进行局部注射的组织器官，采用局部多点注射靶器官可获得较多的特异性和表达效果。
4.病毒量及滴度。根据不同的靶器官组织和所使用的不同AAV血清型（扩散能力不同），推荐注射的AAV量不同，传递到组织中的细菌颗粒数目对于传染效果影响巨大。但AAV使用量并不是越多越好，过多的量或许出现病毒流出，而且按照我们的经验，病毒量很多有之后反而会发生表达减少的状况。想知道确切组织的病毒用量可以联系我们咨询。
5.检测时间。不同基因的表达高峰时间是不同的，再加上AAV需要从单链DNA成为双链DNA，一般在2周可评估到基因表达，如无抗体形成的影响，基因的表达可大幅表达半年以上。
Q3：为什么很少用AAV做细胞感染？
主要是由于AAV转染细胞的表达强度较低，且因为AAV是单链DNA，进入细胞后须经历一个由单链成为双链的过程能够进行转录翻译，而在没有辅助病毒或辅助因子的状况下，这种单链DNA复制产生双链DNA的过程非常缓慢，因此存在表达延迟的状况。
此外，体外细胞的生长速度较快，感染至细胞中的AAV会随着细胞分裂不断稀释，进一步造成其表达水平下降。而在体内研究，注射的组织细胞一般不会有这么快的增殖，且诸多AAV所携带的外源基因表达的因子较为丰富，因此表达丰度和大幅的时间更好。
Q4：如何借助AAV实现体内的特异性表达？
因为目的基因在不同组织中功能不同，以及同一组织的不同细胞中功能也或许不同，所以我们实验过程中常常必须进行特异性表达。AAV可借助以下几种方法推动体内的特异性表达：
1.组织特异性血清型。不同血清型的AAV具有不同的组织嗜性，因此首先要选用对特定组织感染能力强的血清型AAV。
2.（细胞）特异性启动子。血清型主要利用侵染特异性，而开启子则是运用表达特异性，如某些特异性启动子AAV2，可侵染多种组织，但仅在某特定细胞表达。
3.局部注射。此外还可运用Cre依赖性基因开关（Cre-loxp系统），如用特异性启动子含cre酶的AAV注射Loxp小鼠实现特定组织或细胞目的基因的敲除。
Q5：AAV作为一种体内常见的工具病毒，可实现什么功能？
1.基因过表达。将目的基因的CDS区建立到AAV载体，注射到动物体内推动过表达。
2.基因干扰表达。将对于目的基因设计的shRNA构建到AAV载体，注射到动物体内推动干扰表达。
3.目的基因的敲除。将对于目的基因设计的gRNA和Cas9编码序列分别建立到AAV中，注射到动物体内实现基因敲除。
4.内源过表达。将对于目的基因设计的gRNA和dCas9分别建立到AAV载体，实现内源过表达。
Q6：AAV感染后荧光弱？
荧光弱主要有2方面的诱因，一是组织感染的强度较好，另外就是测试的恰当性。对于改善感染效率腺病毒包装技术，则从细菌抗原型是否适合、病毒使用量是否够、滴度是否适合，注射方式能否合理等方面进行预测；而针对检查，在组织样本切片制备的过程中，应考量荧光蛋白的稳定性，如GFP遇酸易于淬灭等原因，从而保证测试的有效性。
此外，AAV病毒使用前需确定能否发生因储存不当而造成滴度增加的状况。
Q7：AAV感染后过表达效果弱？
1.病毒量不够：应充分考察高分文献报道，确定AAV滴度及剂量，对于找不到参考文献的，也欢迎咨询我们。
2.载体表达强度低：更换推进子或降低强调控元件。
3.细胞负反馈模式：少数基因受上下游严格调控，这种状况较难实现过表达。
4.基因序列本来的元件：例如GC含量、隐蔽性剪接位点、转录终止信号和核酸二级结构等，也可妨碍表达。因此，密码子优化广泛用于提高AAV中目的基因表达。
Q8：AAV的表达效果能保持多久？
AAV在细胞内主要是以点状的dsDNA附加体（dsDNA）的方式存在腺病毒包装技术，而不会像慢病毒LV那样融合到寄主细胞的遗传组。对于分裂不旺盛的细胞，如血管元，AAV可大幅表达1年以上并且2年，对于分裂较充沛的细胞，一般也可保持3~6个月或以上。
Q9：AAV的操作、使用安全性如何样？
目前为止，未看到野生型AAV有致病性，实际上大个别人群都感染过AAV。野生型AAV在无辅助病毒（如腺病毒）的存在下，复制效率十分低。重组腺相关病毒（rAAV）由多个质粒（cis质粒、辅助质粒、rep/Cap质粒）组成，且Cis质粒、辅助质粒与rep/Cap质粒之间不具备同源性序列，因此重组AAV在理论上不具备复制的能力。
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